Badania dynamiki białek

Metoda rentgenowskiej analizy strukturalnej oraz technika NMR dostarczają podstawowych danych o trójwymiarowej, "statycznej", strukturze białek. Informacje te są wstępem do lepszego zrozumienia mechanizmów działania białek w procesach zachodzących w żywych komórkach. Wiadomo jednak, że biologicznie aktywne molekuły białka, biorąc udział w procesach komórkowych, nieustannie zmieniają swój kształt. W zależności od stadium takiego procesu, konformacje przestrzenne białek mogą przybierać różne formy. Typowym przykładem mogą być tu białka membranowe, których globularne na ogół kształty w roztworze wodnym ulegają wyraźnym zmianom w czasie łączenia się z dwuwarstwą lipidową. Zmiany konformacji molekuł białka towarzyszą także takim procesom, jak oddziaływanie białko-białko, generacja siły w mięśniach w białkowym kompleksie aktyna-miozyna, przyłączanie molekuł nieorganicznych (np. wiązanie cząsteczek O₂, CO lub NO przez białka zawierające hemową grupę prostetyczną), pochłanianie kwantów promieniowania przez molekuły białka (np. konformacyjne zmiany rodopsyny będące podstawą procesu widzenia), itp.

Odrębną klasę zagadnień reprezentuje dynamika procesów zwijania i rozwijania białka. Doświadczalne określenie poszczególnych stadiów tych procesów oraz poznanie struktur pośrednich jest niezbędnym etapem na drodze do zrozumienia mechanizmów zwijania się białek z liniowych polimerów w trójwymiarowe struktury aktywne biologicznie. Stosunkowo od niedawna, prace eksperymentalne w tej dziedzinie wspomagane są przez coraz bardziej zaawansowane modelowanie teoretyczne (patrz podrozdziały: "Przewidywane struktury", "Białka z perspektywy statystycznej", "Modele zredukowane", "Modele Go").

W dynamice białek zawarta jest także informacja o wielu procesach chorobowych. Jednym z częściej dyskutowanych zagadnień dotyczących patologicznych zmian tego typu jest problem schorzeń wywoływanych przez priony. Termin priony oznacza patogenne odmiany białek naturalnie występujących w organizmie ludzkim lub zwierzęcym. Priony składają się dokładnie z takich samych sekwencji aminokwasów jak ich natywne odpowiedniki. Różnica w ich działaniu w procesach komórkowych wynika z niewielkiej (na ogół) zmiany konformacji molekuły. Obecność patogennych białek (prionów) w organizmie może prowadzić do szeregu nieuleczalnych schorzeń. W szczególności dotyczy to indukowanego przez priony zapalenia mózgu (choroba Creutzfeldta-Jakoba u ludzi oraz jej odpowiednik, gąbczaste zapalenie mózgu, u zwierząt). Częściowa degeneracja niektórych białek oraz postępujące wraz z nią procesy agregacji mogą prowadzić do innych, nieuleczalnych schorzeń takich jak m.in. choroby Alzheimera, Parkinsona, czy też tworzenie się zaćmy w soczewce oka.

Istnieje zatem duże zapotrzebowanie na możliwość obserwowania struktur białkowych w procesach dynamicznych. Z tego powodu wiele metod doświadczalnych stosowanych dotychczas do "statycznych" badań białek (badania na kryształach białek lub w stężonych roztworach), zostało przystosowanych do prowadzenia pomiarów pozwalających obserwować zmiany konformacji cząsteczek białka w funkcji czasu. Najważniejsze grupy metod badawczych wykorzystywanych w badaniach dynamiki białka przedstawiono w tabeli 5.

Dzięki szybkiemu postępowi technicznemu w dziedzinie rentgenowskiej analizy strukturalnej technika ta jest ostatnio wykorzystywana także do badań dynamiki molekuł białka. W szczególności, przy zastosowaniu promieniowania synchrotronowego o dużym natężeniu wiązki, możliwe stały się obserwacje zmian konformacji molekuł białek w roztworach wodnych, w procesach inicjowanych przez skokową zmianę warunków termodynamicznych (np. na skutek szybkiego mieszania substancji denaturującej z białkiem). W technice tej wykorzystuje się fakt, że rozproszenie promieni X przez wodne roztwory białek zależy od lokalnej gęstości elektronów w molekułach białka. Gęstość ta zależy z kolei od stadium zwinięcia się białka i jest najwyższa dla upakowanej formy natywnej (białko zwinięte). W.A. Eaton wraz ze współpracownikami obserwował za pomocą tej metody proces zwijania się cytochromu c, małego białka składającego się ze 104 aminokwasów. Proces zwijania białka w roztworze wodnym inicjowany był przez bardzo szybką zmianę pH. Miniaturowe urządzenie mieszające pracujące w ciągłym przepływie powodowało skok pH z wartości 2 (białko zdenaturowane) do wartości 7 (białko zwinięte). Niskokątowe rozpraszanie promieni synchrotronowych pozwoliło na wykazanie, że cytochrom c zwija się w sposób stopniowy, tworząc silnie upakowane formy pośrednie. Czas tworzenia się form pośrednich został oceniony na ok. 50 μs, przy całkowitym czasie zwijania cytochromu c w warunkach tego eksperymentu ocenionym na 400 μs.

Tradycyjna metoda dyfrakcji promieni X może być także zastosowana do badań dynamiki molekuł białka. W wypadku rentgenowskiej analizy strukturalnej, opartej na badaniu krystalicznych form białka, wykorzystywana jest porowata struktura wielu kryształów białek. Umożliwia to wnikanie w kryształ białka innych cząsteczek (np. cząsteczek wody lub niektórych gazów). Asocjacja takich "dodatkowych" molekuł prowadzi często do zmian w strukturze badanego białka. Jak jednak widać z danych zamieszczonych w tab. 5, do badania szybkich procesów dynamiki białek w środowisku roztworów wodnych najlepiej nadają się metody optyczne. Wolniejsze procesy kinetyczne, zachodzące w skali czasu powyżej 1 s można obserwować za pomocą techniki NMR. W ostatnich kilku latach rośnie zainteresowanie wykorzystaniem techniki elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) do badań kinetyki zwijania się białek. Metoda EPR zostanie szerzej opisana w dalszej części tego artykułu.

Metody optyczne oparte są na ogół na obserwacji zaniku fluorescencji tryptofanu, aminokwasu o właściwościach aromatycznych. Występuje on naturalnie w wielu białkach. Tryptofan znajdujący się w rozwiniętych łańcuchach białkowych wzbudzony światłem laserowym o długości 280 nm emituje fluorescencję o długim czasie zaniku. Dla form zwiniętych białka obserwuje się natomiast gwałtowne skrócenie czasu zaniku fluorescencji. Metoda oparta na obserwacji zaniku fluorescencji tego naturalnie występującego barwnika pozwala obserwować kinetykę zwijania się niektórych niewielkich białek globularnych z rozdzielczością czasową nawet rzędu 1 μs. Za pomocą tej techniki badano, m.in. kinetykę zwijania się niewielkiego białka jakim jest składający się ze 129 aminokwasów lizozym (wyizolowany składnik białka jaja kurzego). Prace Eatona i jego grupy wykazały, że białko to, o bardzo dużym stopniu upakowania w stanie natywnym, zwija się stopniowo, przy czym drugorzędowe struktury (α-helisy) osiągają pełen stopień zwinięcia już po około 50 μs. Podobne wyniki sugerujące wieloetapowy proces zwijania tego białka otrzymano za pomocą techniki NMR (prace S.E. Radforda i C.M. Dobsona). W badaniach dynamiki zwijania lizozymu metodą NMR wykorzystano technikę wymiany protonów (¹H) na deuterony (²H) w grupach amidowych. Wykazano także, że formowanie się innej drugorzędowej struktury, struktury β, przebiega wolniej niż kształtowanie się struktur helikalnych.

Obserwacja procesów zwijania lub rozwijania molekuł białka możliwa jest dzięki sprzężeniu standardowych metod optycznych (jak np. spektrofluorymetria lub badania dichroizmu kołowego) oraz metod rezonansów magnetycznych (NMR i EPR) z wyspecjalizowanymi technikami pozwalającymi na bardzo szybkie zmiany warunków równowagi termodynamicznej w jakich w danym momencie znajdują się molekuły badanego białka. Gwałtowne zmiany takich parametrów fizycznych, jak temperatura (skokowa zmiana temperatury układu) lub ciśnienie (skokowa zmiana ciśnienia), względnie bardzo szybka zmiana stężeń substratów w roztworach zawierających białko, prowadzą do sytuacji, w której białko musi zmienić swą konformację aby dostosować ją do warunków nowej równowagi termodynamicznej. Dla niektórych białek, takie bardzo szybkie zmiany konformacji mogą być też zapoczątkowane przez impuls światła laserowego.

Spośród opisanych technik stosunkowo najszerzej stosowaną obecnie jest metoda szybkiego przepływu i mieszania substratów (tzw. technika Flow/Stopped-Flow). Metoda ta pozwala na obserwację kinetyk zwijania/rozwijania molekuł białka w roztworach wodnych, a więc w środowisku zbliżonym do naturalnego. Procesy te inicjowane są w warunkach szybkiego przepływu i mieszania reagentów. Proces rozwijania (denaturacji) wyzwalany jest na ogół przez szybkie mieszanie roztworu zawierającego białko w stanie natywnym z roztworem czynnika niszczącego trójwymiarową strukturę białka. Typowymi czynnikami niszczącymi globularną strukturę białek są takie substancje, jak stężony mocznik (CH₄N₂O) lub chlorowodorek guanidyny (w skrócie GdnHCl), względnie wysokie stężenie jonów wodorowych (odpowiadają im niskie wartości pH). Zakłada się, że taki chemiczny sposób denaturacji białka polega przede wszystkim na niszczeniu wiązań wodorowych. Dla przykładu, obecność GdnHCl o stężeniu 6 mol/l niszczy trzeciorzędową i drugorzędową strukturę większości białek. Odwrotny proces zwijania inicjowany jest przez szybkie mieszanie roztworu zawierającego rozwinięte (zdenaturowane) białko z odpowiednim buforem, którego obecność zmniejsza efektywne stężenie czynnika denaturującego. W odpowiednio zaprojektowanych mieszaczach proces mieszania reagentów zachodzi w czasie znacznie krótszym niż przebieg czasowy odpowiadający obserwowanej kinetyce. Obserwacja procesów zwijania lub rozwijania białka może być przeprowadzana zarówno w warunkach ciągłego przepływu substratów i zmiennej prędkości mieszania, jak też po szybkim zmieszaniu substratów i zatrzymaniu przepływu. Ten drugi sposób jest często preferowany w badaniach kinetyk zwijania/rozwijania białka, gdyż towarzyszy mu znacznie mniejsze zużycie substratów.